DH10bac感受态细胞

目录号：DH10Bac

保存条件：-80℃，至少6个月干冰运输
，避免反复冻融（冻融之后的感受态不可再保存使用）

产品规格：10×100ul

产品介绍：大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞是经特殊工艺制备的，适用于昆虫杆状病毒Bac-to-Bac系统中同源重组的菌株，用于产生重组Bacmid。使用pUC19 质粒检测，转化效率可达107CFU/ug
，-70°C 保存几个月转化效率不发生改变
。DH10Bac菌株的基因型为
：F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG /pMON14272 / pMON7124

DH10Bac细胞包含亲本Bacmid bMON14272和辅助质粒 pMON7124. 亲本Bacmid包含一个mini-F复制子、卡那霉素抗性基因、att Tn7位点和lac Zα-互补因子。辅助质粒包含tns ABCD区域，该区域提供了mini-Tn7从供体质粒插入亲本Bacmid 靶位点所需要的转座蛋白。供体如pFastBac系列质粒（pFastBac1，pFastBacDual等）含有Tn7R和Tn7L同源重组臂
，Tn7R和Tn7L之间包含庆大霉素抗性基因、昆虫病毒多角体基因启动子、多克隆位点和SV40病毒的PolyA加尾信号。当含有靶基因pFastBac的重组质粒转化到DH10Bac细胞后，发生重组后就可产生重组Bacmid
，提取纯化重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9或Sf21就可以包装产生昆虫病毒。此外
，DH10Bac细胞中的The φ80dlacZDM15基因的产物可以实现β-半乳糖苷酶的α-互补现象，用于重组bacmid的蓝白斑筛选。

操作方法：

1.         向1.5ml EP管管底加入500-1000ng连有目的基因的pFastBac系列质粒（100-200ng/μl的质粒约5μl）
；

2.         从-80^oC冰箱中拿出感受态细胞，冰上解冻4-5min
，待刚解冻时，向EP管中加入100μl感受态细胞，立即放入冰上冰浴
。此步要轻柔快速地吸取，勿吹打，勿涡旋
，若感受态细胞解冻过久未用，最好重新取一管使用
；

3.         冰浴30min后
，42^oC热激45s。超净台内加入LB或SOC培养基900μl，37^oC
，200-220rpm/min，培养4h；

4.         1000×g离心10min后，倒掉部分上清
，EP管内保留约200-300μl左右的上清液

，用枪轻柔吹打重悬沉淀；

5.         吸取100μl重悬的菌液涂布到含有IPTG和X-gal的多抗平板上，37^oC培养48h左右。挑取最大，最白的菌斑
。

注意事项:

l  本步骤中所有试剂的用量均为本批次感受态细胞效价后获得，与官方说明书在某些细节上略有不同，仅适用于本批次DH10Bac感受态细胞。

l  本实验过程中涉及多次转化和重组反应
，最终的转化效率受到很多因素影响。平板上白斑较少且伴随很大比例的蓝斑属于正常现象，能挑到白斑即可。并且在转化之前请确认质粒的纯度（A₂₆₀/A₂₈₀及A₂₆₀/A₂₃₀）处于良好的范围内。并保证多抗平板内抗生素
，IPTG和X-gal的浓度严格按照Bac-to-Bac官方说明书上配置。

l  第五步中剩余的菌液最好保留
，若发现斑较多，可以将剩余菌液复苏后稀释涂板
。若发现斑较少

，可以复苏后再培养1-2h，再离心重新涂布。